Remoção de sais e detergentes em amostras de peptídeos usando StageTip

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Reagentes

• Solução A: Acetonitrila 5%, ácido acético 1%

• Solução B: Acetonitrila 80%, ácido acético 1%

• Solução C: 500 mM NaCl, ACN 15%, ácido acético 1%

• Metanol


Materiais

• Malha de teflon contendo C18 (Empore 3M, #2315)

• Malha de teflon contendo SCX (Empore 3M, #2251)

• Malha de teflon contendo C8 (Empore 3M, #2314)

• Tips amarelos (para pipeta de 200ul)

• Tips azuis (para pipeta de 1ml)

• Eppendorfs de 1.5 ml e 500 ul

• Agulha de seringa longa e sem ponta


Métodos

Confecção do StageTip

1. Recortar a ponta de um tip azul para aumentar o orifício a ~5mm ou utilizar uma agulha de seringa sem ponta.

2. Pressionando o tip ou a agulha na membrana de C18, C8 ou SCX, retirar a membrana de ~5mm de diâmetro. Para facilitar o corte da membrana, pode-se molhar as membranas com metanol.

3. Com a ajuda de um capilar, empurrar a membrana para a ponta de um tip azul (caso a massa de peptídeos seja maior que 50 e menor que 100 ug) ou amarelo (caso a massa de peptídeos seja ≤ 50 ug), de modo que a membrana fique a ~1mm da ponta, e a membrana ocupe ~2mm na ponta do tip (Fig 1A)

Obs. Para amostras contendo grande quantidade de detergente (CHAPS, Triton e SDS), fazer os passos 1-3 usando membrana de C18, SCX e novamente de C18, de modo que formem um “sanduíche” de SCX (Fig 1B).

4. Colocar o tip em um eppendorf de 500 ul com o fundo cortado, e este eppendorf em um outro de 1,5 ml (Fig 1C) para coletar o flow-through.


Procedimento de dessalinização - Condicionamento e purificação (ponteiras de 200 ul)

Obs. Em cada passo de condicionamento centrifugar a no máximo 3000 rpm por aproximadamente 15 segundos

Obs. Uréia é tolerada até 2M

Obs. A concentração de solvente orgânico não deve ultrapassar 5%

1. Condicionar as membranas com 50 ul de metanol e, antes de a membrana secar, condicionar com 50 ul de solução B . Caso a membrana seque, repetir todo o procedimento de condicionamento.

2. Lavar a membrana com 50 ul de solução A. Centrifugar. Obs. Não deixar a membrana secar

3. Ressuspender as amostras em 50 ul de solução A (as amostras devem estar em pH ≤ 3)

4. Carregar as amostras na membrana (até 50 ug). Centrifugar. Descartar flow-through

5. Lavar com 50 ul de solução A. Centrifugar e descartar flow-through

6. Eluir os peptídeos com 50uL de solução B. Centrifugar. Coletar o eluato em um novo tubo. Para aumentar o rendimento, reeluir com 50 uL de solução B

7. Concentrar a amostra de peptídeos em speedvac. Se necessário, checar o volume a cada 2 min. Evitar a completa secagem para evitar a perda de peptídeos

Obs. Esta amostra pode ser congelada em -80C até o momento do uso.


Procedimento de dessalinização e remoção de detergentes - Para amostras a serem purificadas com C18, SCX e C18 (ponteiras de 200 ul)

1. Condicionar as membranas com 50 ul de metanol, 50 ul de solução B, 50 ul de solução A, 50 ul de solução C e novamente com 50 ul de solução A

2. Ressuspender as amostras em 50 ul de solução A;

3. Carregar as amostras na membrana de C18 (até 50 ug). Descartar flow-through;

4. Lavar a membrana com 50 ul de solução A. Descartar flow-through;

5. Eluir os peptídeos da membrana de C18 com 50 ul de solução B (coletar o flow-through e fazer processo de remoção de detergentes e dessalinização utilizando uma outra ponteira com membranas de SCX e C18);

6. Lavar a membrana com 50 ul de solução A. Descartar o flow-through;

7. Eluir os peptídeos da membrana de SCX com 50 ul de solução C. Descartar flow-through;

8. Lavar a membrana com 50 ul de solução A. Descartar flow-through;

9. Eluir os peptídeos com 50 ul de solução B. Coletar o eluato em um novo tubo;

10. Concentrar a amostra de peptídeos em speedvac. Se necessário, checar o volume a cada 2 min. Evitar a completa secagem para evitar a perda de peptídeos

Obs. Esta amostra pode ser congelada em -80C até o momento do uso.

Antes de proceder para as análises no LC-MS/MS

11. Concentrar a amostra em speedvac. Se necessário, checar o volume a cada 2 min.

12. Evitar a completa secagem para evitar a perda de peptídeos

Obs. Esta amostra pode ser congelada em -80C.

13. Diluir a amostra com 0,1% ácido fórmico antes de proceder com a análise no LC-MS/MS


Referências

Este protocolo foi modificado de Stop-and-go extraction tip, Rapppsilber e colegas, 2007.